梨树苗黑斑病菌快速检测技术

一、针对的产业问题

梨黑斑病是梨苗主要叶部病害之一，在中国梨主产区普遍发生，是梨产业健康发展的重要限制因子之一。建立梨黑斑病菌快速检测技术，可以实现对该病害的早期诊断，并可对田间梨树发病过程进行实时监测，更有助于了解病害的发生及发展规律，为制定病害防治方案提供理论基础和技术支撑。

二、技术要点

1.样品采集

在梨树生长的各个时期，在梨园中随机采样50份，每份样品至少包括50个叶片或果实。

2.核酸(DNA )快速提取

每毫克梨组织加人10微升0.5摩尔/升的氢氧化钠 (NaOH )溶液，在研钵中充分研磨后转移至1.5毫升的离心管中，在小型离心机中以12 000转/分的转速离心5分钟，取5 微升上清液加入495微升0.1毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(Tris-HCl，pH值8.0 )，混匀后取1微升直接用于PCR 反应。提取过程约需15分钟。

3.引物序列

弓I物 AAF2 ： 5’ -TGCAATCAGCGTCAGTAACAAAT-.V

引物 AAR3 ： 5’ -ATGGATGC;rAGA(：(rrTTGC

4.常规PCF1检测

反应体系•• 25微升，包括1微升模板DNA、0.5微摩尔引 物、2微升dNTPs(2.5毫摩尔)、2.5微升10倍PCR反应缓冲液、2毫摩尔Mg2+、1.25单位raq酶。用灭菌超纯水将体系 补足至25微升后，在普通PCR仪上进行扩增反应。反应程序•• 95T预变性5分钟;然后进入循环，941变性30秒，60尤退火 30秒，72T延伸40秒，共35个循环;最后72T延伸8分钟。

反应过程需2小时。

5.检测结果分析反应结束后取7微升扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳(电压：100伏;时间：30分)。在凝胶成像系统或常规紫外观察 仪中观察有无目的条带(340个碱基对大小，340bP)。

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

特异性引物AAF2/AAR3 PCR扩增kalternata电泳泳道 M: 2 000 bp DNA marker;泳道 1-6: A.altemata isolates;泳道 7-13: B. berengeriana; Valsa ambiens;.Phoma sp; Mycosphaerella sentina; Erwinia amylovora; AI te maria solani; Fusarium equiseti;泳道 14: H20

三、适宜区域 中酿梨产区。

四、注意事项

1 .样品采集后需保持新鲜，并及时送往相关单位检测。

2.根据阳性检测样品占被检测样品的西分比大小，结合当 地气候条件，及时开展防治工作。

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